Evolution i fast forward: Mikroorganismer skal hjælpe med at gøre menneskeheden bæredygtig

At skabe balance er nøglen. I de seneste år har menneskeheden stræbt efter at genoprette den delikate ligevægt mellem sin evige søgen efter større velstand og velbefindende og en planet og et klima, der kæmper for at følge med. Overraskende nok viser planetens mikroorganismer sig som vigtige allierede i denne kamp for balance. Jack Pronk har dedikeret sin karriere til at søge hjælp fra gær, bedst kendt for deres rolle i brødhævning og ølbrygning. Ikke desto mindre kan disse mikroorganismer med lidt omhyggelig tilskyndelse og afbalancering bidrage langt mere betydeligt.

"Vores drøm er at etablere en bio-baseret økonomi ved hjælp af bakterier, gær og svampe. Et eksempel er produktion af brændselsetanol fra sukkerrør eller majs ved hjælp af gær, som effektivt omdanner glukose til ethanol. Det er dog lidt kontroversiel, da det konkurrerer med fødevareproduktion. For at løse den udfodring udforsker vi, og har allerede identificeret, metoder til at modificere disse organismer. Dette gør det muligt for dem at omdanne landbrugs- og skovaffald til biobrændstoffer og fine kemikalier," forklarer Jack Pronk, Professor and Head of the Department of Biotechnology at Delft University of Technology (TU Delft) in the Netherlands.

Overlevelse under is

Jack Pronk har altid været fængslet af naturen, og har udforskede den både på makro- og mikroniveau, dels som en dedikeret lystfisker, og dels ved konstant at søge at forstå videnskaben bag den. Derfor var det en naturlig beslutning for ham at studere biologi ved Leiden Universitet. Dog blev han desillusioneret allerede efter kun et år af BSc-studierne med lærebøger fyldt med information om anatomi og systematikken af planter og dyr.

"Jeg var klar til at opgive. Og selv hvis jeg fortsatte, så jeg mig selv som en kommende underviser på fuld tid. Heldigvis overtalte mine forældre mig til at give det chancen endnu et år. Og på andet år havde vi så praktiske øvelser i laboratorie. Min gruppe arbejdede med dyrefysiologi, og vi forskede i karper—og især deres muskelvæv. Det var første gang, jeg virkelig tænkte, 'Wow, forskning er sejt!' Så på en måde fik fiskene fanget mig i forskningens tjeneste."

Karpers evne til at overleve under is i lange perioder skyldes alkoholisk fermentering. Den praktiske undersøgte dette fænomen ved at isolere mitokondrier og udføre enzymassays. I løbet af hans MSc-studier i biologi fokuserede hans største forskningsprojekt på plantemolekylærbiologi, undersøgte mekanismen, hvormed Agrobacterium kan overføre DNA til planter.

"Et andet forskningsprojekt handlede om at inducere bakterier til at producere organiske syrer. Det gjorde mig kun endnu mere begejstret. I modsætning til venteperioderne på måneder i andre forskningsområder, følte jeg her, at jeg opnåede nye resultater hver dag. Dette antændte virkelig min interesse for forskning som en mulig karrierevej."

Ekstremt sure miljøer

Jack Pronk afsluttede sin MSc i biologi i 1986 før han fik sin PhD-grad i mikrobiologi fra TU Delft i 1991.

"Under min PhD studerede jeg Thiobacillus-bakterier, og især de særprægede syre-elskende arter, der trives ved pH-værdier så lave som 1.6—virkelig ekstreme forhold. Så ekstreme, at rustfrie ståldele af de dyre dyrknings-opsætninger nogle gange begyndte at opløses."

Acidithiobacillus ferrooxidans er afgørende i biologisk udvaskning af metalmalm ved at oxidere jern- og svovlforbindelser fundet i malmen. Denne proces opløser metaller som kobber, guld og uran, hvilket letter deres ekstraktion.

"Disse syre-elskende bakterier kan anvendes til at genindvinde metal fra malm, men de spiller også en rolle i naturlige miljøer, hvor svovlholdige mineraler og/eller jern er til stede. Mit ph.d.-projekt søgte at forstå deres fysiologi bedre."

En overraskelse, der opstod fra ph.d.-projektet, var at Acidithiobacillus ferrooxidans ikke kun kan vokse på svovlforbindelser og jern, men også på myresyre - en forbindelse, der er meget giftig under sure forhold. Ved at lave kontrolleret fodring, kunne meget højere tætheder af bakteriekulturne opnås.

"Det mest fascinerende resultat af min ph.d.-forskning var åbenbaringen, at Acidithiobacillus ferrooxidans også besidder evnen til at reducere jern-forbindelser, hvilket muliggør respiration og vækst i anaerobe forhold. Denne uventede fleksibilitet i mikroorganismer adfærd gjorde stærkt indtryk på mig og er siden blevet en drivkraft i min karriere."

Kunne ikke have været på et bedre tidspunkt

Jack Pronk skiftede til gærforskning via en blanding af held og strategisk planlægning. Han skulle have været i militærtjeneste og var allerede blevet indkaldt, men hans tjenester var nødvendige andre steder.

"I løbet af mine ph.d.-studier erhvervede jeg licensen til at være radiologisk sikkerhedsofficer. På det tidspunkt havde vores afdeling et stort isotop-laboratorium, og ved afslutningen af min ph.d. var jeg den eneste person med den kvalifikation. Dette gav min ph.d.-vejleder og daværende afdelingschef, Gijs Kuenen, ammunitionen til et brev til Forsvarsministeriet."

Jack slap for tjeneste, og lige i det øjeblik opstod der en ledig stilling for en adjunkt i TU Delft i gærgruppen, ledet af Hans van Dijken. Dette markerede begyndelsen på hans rejse ind i verdenen af gærfysiologi og molekylærbiologi.

"Set i bakspejlet," bemærkede Jack Pronk, "faldt jeg hovedkulds ind i gærforskningen. Og det kunne ikke have været på et bedre tidspunkt, virkelig."

Et held

I midten af 1990'erne skete to afgørende fremskridt i gærforskningen. Først blev den komplette genomsekvens af gær - Saccharomyces cerevisiae - offentliggjort i 1996, hvilket muliggjorde målrettet genetiske modificering. For det andet begyndte feltet for metabolic engineering at tage fart.

"På det tidspunkt specialiserede vores laboratorium sig i at dyrke mikroorganismer under stramt kontrollerede forhold i kemostater. Disse bioreaktorer var uvurderlige både for grundlæggende forskning og for kvantitativ undersøgelse af industrielle procesforhold. Kombinationen af dette med gærgenetisk ingeniørarbejde, fangede sandsynligvis opmærksomheden hos mine kolleger fra Stanford University, pionerer i brugen af Affymetrix (nu Applied Biosystems) mikroarray."

Affymetrix mikroarray-teknologi revolutionerede genetisk forskning i slutningen af 1990'erne ved at muliggøre samtidig analyse af udtrykket af tusindvis af gener. Ved at indlejre DNA-prober på chips forenkledes den ekisterende langsommelige proces hvor man analyserede et gen ad gangen.

"Kollegerne fra Stanford havde udtænkt et meget elegant eksperiment, der kombinerede kemostater og mikroarrays, og spurgte, 'Kan vi sende nogen over for at køre kulturerne?' Dette held gjorde det muligt for os at bruge og efterfølgende erhverve et DNA mikroarray-opsætning meget tidligt i forhold til andre, hvilket blev et afgørende øjeblik i opbygningen af vores forskningskapacitet."

Hold deres maskineri kørende

Den nye opsætning gjorde det muligt for Jack Pronk og kolleger at avancere betydeligt deres forståelse af gærfysiologi og -metabolisme. Studierne afslørede, hvordan disse små organismer håndterer deres energi og vokser under forskellige forhold, især med fokus på deres interaktioner med ilt og udnyttelse af forskellige næringsstoffer.

Forståelse af disse processer i gær er ikke bare af akademisk interesse. Store industrielle processer til fremstilling af brød, øl og vin—men også biobrændstoffer og kemikalier—afhænger af optimalt at tilpasse gærcellernes metabolske maskineri til de relevante procesforhold.

"Ølbrygning og industriel produktion af ethanol afhænger af evnen hos nogle gærceller til at vokse i fuldstændig fravær af ilt. Gennem min karriere har jeg været fascineret af spørgsmålet om, hvorfor kun meget få af de tusindvis af kendte gærarter mestrer dette trick."

Potentialet af de nye genomiske mulighed for videnskaben men især for industrielle innovationerog applikationer var heller ikke gået ubemærket hen i politik.

"Ved århundredeskiftet havde vi en fremsynet regering, der anerkendte potentialet af de nye genomiske teknikker til at tackle store samfundsmæssige udfordringer. De etablerede Netherlands Genomics Initiative."

Udbrændthed og comeback

Ved at oprette flere virtuelle forskningscentre, hvor forskere fra forskellige forskningsinstitutter, universiteter og industrisamarbejdspartnere samarbejdede, sigtede den hollandske regering mod at fremme genomforskning og dens anvendelse. Et sådant initiativ var The Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, der havde til opgave at udforske fermenteringsprocesser til produktion af fødevarer, lægemidler, biobrændstoffer og biokemikalier.

"Jeg var netop blevet udnævnt til Antoni van Leeuwenhoek Professor i Industriel Mikrobiologi ved TU Delft. Kolleger insisterede på, at jeg ville være en god leder for dette initiativ. De sagde 'Du kan klare det', så jeg påtog mig opgaven. Jeg er stadig taknemmelig for deres tillid og glad for, at jeg ikke løb fra det ansvar. Det udløste dog en både traumatisk som lærerig oplevelse."

Som mange andre akademikere havde Jack Pronk ubevidst kæmpet med imposter-syndrom i lang tid. En udbrændthed skulle vise sig at blive den mest værdifulde oplevelse i hans karriere.

"I takt med at jeg reflekterede over tidligere oplevelser, afviste jeg ofte komplimenter vedrørende mine præsentationer. Jeg troede bare, at de var høflige gestusser. På trods af at have opnået fuldt professorat i en alder af 35, nærede jeg tvivl om mine evner, frygtede at held spillede en afgørende rolle, og at mine mangler en dag ville blive afsløret. Nu indser jeg, hvordan denne usikkerhed kan drive individer til at overgå forventningerne, men den kan også føre til usund perfektionisme, hvor en person føler, at de konstant må give mere end 100% for at undgå at blive afsløret."

En masse Bach, fiskeri, støtte fra kolleger, der havde gennemgået den samme oplevelse, og professionel hjælp gjorde det muligt for Jack Pronk at komme stærkere tilbage.

"Jeg lærte, at jeg ikke konstant behøvede at måle mig selv mod urealistiske mål eller andre, men også at værdsætte det, der går godt. Det lærte mig vigtigheden af at lære min agen 'manual' at kende, hvilket jeg tror er en del af livslang læring for os alle."

Kritisk forhindring i opskalering

Hans comeback viste sig at være en ekstraordinær succes. Jack Pronk ledte The Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation de kommende 12 år som videnskabelig direktør, og hans forskning ved TU Delft bevægede sig i nye retninger. Ved århundredeskiftet førte den stigende fokus på, at fossile brændstoffer forårsagede klimaforandringer til en stigning i interessen for bioethanol som et alternativ til konventionelle transportbrændstoffer. At tackle udfordringerne relateret til bioethanolproduktion blev derfor et af hans mål.

En betydelig udfordring i produktionen af bioethanol var at bruge rå plantebaserede materialer som råstof. Mens traditionelle gærstammer, såsom Saccharomyces cerevisiae, kunne fermentere 6-kulstofs (hexose) sukkerarter fra frugter, grøntsager og korn effektivt, kæmpede de med de 5-kulstofs (pentose) sukkerarter, der almindeligvis findes i den biomasse, der kommer fra landbrugsrester, træ og græsser.

Denne type biomasse indeholder betydelige mængder af de to pentose sukkerarter xylose og arabinose, men gær har ikke de metaboliske redskaber, der er nødvendige for at omdanne disse sukkerarter til ethanol.

"Denne begrænsning hindrede den effektive omdannelse af landbrugsrester, såsom halm og resterende majsstilke, til ethanol, hvilket præsenterede en kritisk forhindring i opskaleringen af bioethanolproduktion fra ikke-fødekilder."

Indisk elefantlort

Tidligere forsøg på at løse pentose-udfordringen havde stort set baseret sig på at introducere to nye enzymer i gærmetabolismen: xylose reduktase og xylitol dehydrogenase. På trods af mange elegante studier var denne to-enzym-løsning udfordrende at regulere og kontrollere. Jack Pronk og kolleger var overbeviste om, at svaret kunne omfatte en helt anden slags enzym, da han mødte kollegaen mikrobiolog Huub Op den Camp fra Radboud Universitet Nijmegen.

"På det tidspunkt arbejdede Huub med en svamp, han havde isoleret fra elefantlort. Han var ikke involveret i forskning på pentoser, men da Huub beskrev et specifikt stykke DNA fra svampen, indså jeg, at det kunne være nøglen til vores problem. Sammen demonstrerede vi, at introduktionen af svampegenet i Saccharomyces cerevisiae var the missing link."

I den anaerobe svamp Piromyces sp. strain E2, isoleret fra afføringen af en indisk elefant, fandt Jack Pronk og hans samarbejdspartnere, hvad mange havde søgt—et xylose isomerase gen, der fungerede godt i gær.

"Dette resultat indledte års forskning, som i stigende grad også involverede samarbejde med det hollandske firma DSM. Gennem denne proces blev Saccharomyces cerevisiae tilpasset til at behandle pentose sukkerarter fra mængderne af landbrugsaffalds."

Stadig stort potentiale

Omkring 2010 kunne den modificerede gær omdanne alle relevante sukkerarter fra planteaffald til ethanol effektivt, hvilket banede vejen for mere bæredygtige biobrændstofproduktionsteknologier og minimerede afhængigheden af fødeafgrøder som råstof.

"Kun fire år senere åbnede DSM og det amerikanske ethanolproducerende firma POET sammen et fuldskala anlæg til produktion af brændsels-etanol fra majsrester. Anlægget kørte i en række år, indtil faldende oliepriser og en skiftende politisk kontekst tvang produktionen til at blive afbrudt."

På trods af dette tilbageslag mener Jack Pronk, at produktionen af bioethanol fra landbrugsrester vil gøre comeback. Ethanol er ikke kun nyttig som transportbrændstof, men også som forløber for kemiske forbindelser, der spænder fra ethylen til flybrændstof.

"Jeg ser stort potentiale for ethanol, produceret ved de her teknologier, som en generisk råvare til produktion af protein til føde, lægemidler og kemikalier. Der er stadig enormt potentiale for dens produktion fra landbrugsrester. Jeg er overbevist om, at genetisk modificerede mikroorganismer - gær, bakterier eller svampe - vil muliggøre omkostningseffektiv og bæredygtig ethanolproduktion fra disse råstoffer."

Mærkelige og vidunderlige svampe

Mindst lige så vigtigt er det, at xylose isomerase-eksemplet har vist, at disse slags produktioner er skalerbare. Med evnen til at modificere gær er det nu enkelt at udvikle stammer til produktion af andre værdifulde produkter fra lignocellulosebiomasse. Dog er en grundlæggende forståelse af gærfysiologi og vækst lige så vigtig. I 2016 modtog Jack Pronk et European Research Council (ERC) Advanced Grant til at undersøge og eliminere iltkravene i gær.

"Vi søgte inspiration i genomerne fra en evolutionært gammel gruppe af svampe, Neocallimastigomycetes, eller Neos. Disse mærkelige og vidunderlige svampe lever i de iltfrie tarme på store planteædere. Gennem evolutionen har deres massive genom erhvervet en væld af bakterielle gener, samt modifikationer i deres egne gener, der har hjulpet dem med at tilpasse sig livet uden ilt."

Vækst af Saccharomyces gærstammer uden ilt kræver særlige anaerobe vækstfaktorer: molekyler såsom steroler, umættede fedtsyrer og vitaminer. Undersøgelsen af Neocallimastigomycetes' metoder hjalp Jack Pronks team med at reducere disse behov, øge robustheden af Saccharomyces gær i anaerobe processer og udvide deres egnethed på tværs af gærarter.

"Neos fungerer som et slående eksempel på naturens evne til at udføre genetisk modificering gennem overførsel af DNA på tværs af arter. Denne proces er et vidnesbyrd om at naturlig evolution sker i et omfang, der er svært at tro på. Uden at nedtone de fantastiske muligheder ved syntetisk biologi, har vi kun lige begyndt at udforske de muligheder, der allerede tilbydes via mikrobiel biodiversitet ude i denne forunderlige verden."

Brygning og antibiotika

I det seneste årti tog Jack Pronk og hans team endnu et betydeligt skridt hen imod at skabe en mere effektiv og bæredygtig metode til produktion af ethanol, der nu anvendes i fuldskala i ethanolindustrien i USA. Til denne opfindelse fik de hjælp fra hans gamle bekendte, Thiobacillus bakterierne. Dog var det ikke metal-spisende variant, men en slægtning, Thiobacillus denitrificans, hvorfra forskerne lånte et gen til at finjustere ethanolproduktionen ved hjælp af gær.

"Ved at sætte nogle plante-lignende CO2-fikseringsenzymer—der findes i den såkaldte Calvin-cyklus—ind i en gærstamme, skabte vi en mere effektiv omdannelse af CO2 til ethanol ved at minimere det uønskede biprodukt glycerol skabt under gærvækst. På denne måde kan vi skabe en endnu mere økonomisk produktionsproces og reducere miljøpåvirkningen ved at co-anvende noget CO2."

Gennem årene har Jack Pronks forskning og viden om gær gavnet langt flere industrier end bare bioethanolproduktion. Hans samarbejde med DSM og andre partnere har resulteret i 17 patenter og spænder over forskellige sektorer, inklusiv produktion af vigtige kemikalier såsom lactat og pyruvat, brygning og antibiotika. I 2018 tog hans karriere endnu en ny drejning.

"Dekanen trådte ind i mit kontor og sagde, 'Din institutleder forlader os. Vi har brug for en midlertidig. Ville du være okay med at overtage det?' Og mit svar var, 'Ja, selvfølgelig.' Han spurgte derefter, om jeg ønskede at være institutleder i en længere periode. Mit mindre hjælpsomme svar var, 'På ingen måde.'"

Seks år senere er Jack Pronk dog stadig leder af Department of Biotechnology at Delft University of Technology. På spørgsmålet om, hvordan hans karriere tog de vendinger, som den har gjort, er svaret:

"Mennesker tror, de er rationelle. Vi er alt andet end rationelle, men vi er fremragende til at rationalisere efter faktum. Det gælder især i beskrivelsen af ens karrierevej, hvor valg synes logiske i bakspejlet, men ofte er drevet af helt andre og ofte dybere motivationer. Ved skilleveje har råd fra familie, venner og mentorer, både inden for og uden for videnskab, været uvurderlige, inspirerende mig og med til at  forme beslutninger, der nok allerede var ved at tage form inde i mig - ubevidst."

Vi bør sætte dette ind i gær

Jack Pronks karriere bekræfter denne uforudsigelighed gennem hans banebrydende forskning i industriel mikrobiologi, især hans arbejde med Saccharomyces gær i produktionen af biobaserede brændstoffer og kemikalier.

"Vores drøm er at bruge mikrobielle processer til at erstatte eksisterende kemiske, fossile-baserede processer, og dermed skabe bæredygtige alternativer til traditionelle. Især i akademisk forskning er det vigtigt at anerkende uforudsigeligheden af, hvilken forskningslinje der i sidste ende vil nå fuldskala anvendelse. Vores rolle er at kontinuerligt udforske og generere nye muligheder og i processen uddanne nye generationer af videnskabsmænd."

Til at videregive viden har Jack Pronk altid været passioneret omkring undervisning og mentor-rolle for morgendagens forskere—og selvom tiden er blevet mere knap til det på grund af hans rolle som institutleder, prioriterer han stadig at undervise førsteårs-studerende.

"Jeg nyder virkelig med at interagere med studerende—ikke bare for at undervise dem, men også for at hjælpe dem til at forstå processen."

Et bemærkelsesværdigt eksempel på Jack Pronks aktionsprægede undervisningsfilosofi  opstod under et foredrag, da en spontan ny indsigt opstod under undervisningen.

"Jeg elsker at undervise som en duo, enten med et erfaren kollega eller med en talentfuld PhD-studerende. En dag, mens jeg lyttede til min medunderviser og kiggede på det slide, han viste, tænkte jeg, 'Vi burde prøve at indsætte det her enzym i gær,' men jeg sagde det ikke til nogen lige med det samme, fordi ideen føltes lidt for god til at være sand, så måske tog jeg fejl. I pausen gik jeg hen til min medunderviser og spurgte, 'Skal vi prøve dette?' Sammen vejledte vi et PhD-projekt, der omsatte en den her idé til en teknologi, der i dag anvendes i industrien."