Dansende proteiner kommer under lup i stort dansk forskningsprojekt

Der findes ikke noget som et nedbrudt videnskabeligt paradigme, der kan få forskere til at spærre øjnene op.

For professor Birthe B. Kragelund fra Biologisk Institut ved Københavns Universitet skete det store paradigmefald omkring årtusindeskiftet, hvor kortlægningen af det humane genom gjorde det soleklart, at 30 procent af alle vores proteiner slet ikke opfører sig på den måde, som alle molekylærbiologiske lærebøger ellers beskriver, at de bør gøre.

I stedet for at være foldet i faste strukturer, som indtil da havde være en indiskutabel sandhed, når snakken faldt på proteinernes form og funktion, var de i stedet uordnede og dynamiske som kogte, dansende spaghettier. Det pillede som ved et trylleslag 100 års lærebogsforståelse af proteiner fra hinanden.

Opdagelsen åbnede også op for et helt nyt forskningsområde i disse proteiner, og inden for de seneste 20 år har forskere slået fast, at de uordnede proteiner ikke bare er kuriositeter, men spiller altafgørende roller i biologi og i udvikling af kræft og neurodegenerative sygdomme som Alzheimers og Parkinsons.

Man kan gå så vidt som til at sige, at hvis forskere ikke lærer at forstå de uordnede proteiner, vil der være nogle sygdomme, som vi aldrig får skovlen under.

”Der vil højst sandsynligt være sygdomme, som vi ikke kan behandle, før vi finder ud af, hvordan de her proteiner opfører sig, og der er vi ikke endnu. Men vi er alligevel kommet langt de seneste 20 år. Når jeg før i tiden holdt foredrag om min forskning i uordnede proteiner, stillede folk mange kritiske spørgsmål, fordi deres forståelse af proteiner stadig hang fast i lærdommen fra lærebøgerne. Sådan er det heldigvis ikke i dag, hvor man i langt i de fleste forskningsfelter anerkender, at nogle proteiner opfører sig markant anderledes end andre, og at vi slet ikke har styr på, hvorfor de opfører sig, som de gør, og hvad det har af betydning for både sygdom og et godt helbred,” siger Birthe B. Kragelund.

Birthe B. Kragelund har modtaget en stor Challenge Programme-bevilling fra Novo Nordisk Fonden til at udvide hele verdens forståelse af de 30 procent af vores proteiner, som vi i dag ikke ved særligt meget om.

Proteiner, der ikke opererer med struktur og orden

Det videnskabelige navn for de uordnede proteiner er intrinsically disordered proteins eller IDP’er – dynamiske proteiner uden form.

IDP’er adskiller sig fra resten af vores proteiner ved at være fuldstændigt bedøvende ligeglade med struktur og orden.

Normalt, hvilket også har være lærebogsstof i 100 år, er det sådan, at proteiner folder op i nogle smukke og præcise strukturer.

Strukturerne af forskellige proteiner er direkte koblet til deres funktionalitet på den måde, at forskellige aktive områder i et protein kan vekselvirke med omgivelserne ved at være præcist organiseret i en tredimensionel struktur.

Nogle af de bedst studerede proteiner er for eksemplets skyld enzymer, og for at de kan vekselvirke med andre molekyler i cellen, skal deres tredimensionelle struktur være organiseret på en måde, så enzymets kemiske sidegrupper kan gribe fat i de givne bindingspartnere på præcis de steder, hvor der kan gribes fat, og den efterfølgende kemiske reaktion kan foregå.

Med andre ord, en lås kan kun åbnes, hvis proteinnøglen passer præcist.

”Det smukke er, at når vi kender til et proteins struktur, kan vi med forholdsvis stor sikkerhed sige noget om vi dets funktionalitet. Det er ligesom med en stol. Når vi ser en stol, uanset hvordan den er designet, kan vi regne os frem til, at den er til at sidde på,” forklarer Birthe B. Kragelund.

Ligner ikke andre proteiner, men har alligevel funktion

Når ”normale” proteiner folder op i strukturer, sker det i store træk helt automatisk, i hvert fald for små proteiner.

Forskellige kemiske egenskaber i de aminosyrer, som samlet i en kæde udgør et protein, sikrer, at proteinerne folder om sig selv og danner en forudbestemt struktur.

De kemiske egenskaber i aminosyrer er afgørende for denne proces. De kan som eksempler være affinitet for vand eller fedt. Når aminosyrerne søger ind mod midten eller ydersiden af proteinet, danner det samlede protein en struktur, hvor de fedtelskende aminosyrer overvejende vender ind mod midten af proteinet, og de fedtforskrækkede vender udad.

En Nobelpris er endda blevet givet til Christian B. Anfinsen, som viste, at hvis man folder et protein ud af dens struktur, mister proteinet sin funktionalitet, men hvis man derefter lader proteinet være i fred, og det får lov til at folde op igen, genvinder det den tabte funktionalitet. Folden var kodet inde i rækkefølgen af aminosyrerne i kæden.

”Antagelsen omkring IDP’erne var derfor indledningsvist, at det måtte være proteiner uden funktion, for hvordan kunne de have funktion uden struktur? Allerede tidligt viste det sig dog, at proteinerne har funktionalitet, og at tab af funktion spiller ind i udvikling af forskellige sygdomme. Det viste sig også, at IDP’erne kan være meget dynamiske i deres binding til en bindingspartner, men hvordan kan man både være dynamisk og binde lige så stærkt som ellers? Og hvordan forklarer vi specificitet? Hele vores proteinparadigme blev slået i stykker af IDP’erne,” siger Birthe B. Kragelund.

Mennesker har flere ustrukturerede proteiner end bakterier

Hvis vi skal kigge lidt på, hvad IDP’erne er for nogle, og hvad de kan, har forskere slet ikke et komplet billede endnu, men det er netop det, som Birthe B. Kragelund med sit forskningsarbejde vil råde bod på.

For det første har den indledende forskning i IDP’erne vist, at de godt kan indgå i mere eller mindre faste strukturer, hvis de binder til et andet protein. I det tilfælde kan dele eller hele proteinet folde op – ikke af sig selv, men ved bindingen.

Når IDP’erne skal binde til et andet protein, sker det ofte via et motiv bestående af en kort aminosyresekvens på mellem 3 og 11 aminosyrerester i det uordnede protein. Denne sekvens binder til en overflade eller en fordybning på et foldet protein. IDP’erne kan have mange forskellige motiver og dermed arrangere mange andre proteiner i et større samlet proteinkompleks.

Ydermere har forskningen vist, at proteinerne kan vekselvirke meget mere med omgivelserne end de faststrukturerede proteiner.

”Det betyder, at vi skal betragte gruppen af IDP’er som en helt særlig type proteiner, der tjener helt specielle roller i vores celler. Et protein med fast struktur kan typisk én ting, og det modsvarer måske en brødkniv i køkkenskuffen. Den er til at skære brød med. IDP’erne kan derimod mange forskellige ting og modsvarer derfor en schweizerkniv med mange forskellige mulige funktionaliteter afhængigt af bindingspartneren og cellens behov,” forklarer Birthe B. Kragelund.

Forskningen har også vist, at højerestående organismer har flere IDP’er og derfor formentlig også behov for flere proteiner med multifunktionalitet.

Bakterier har for at eksemplificere pointen meget få IDP’er, mens forskere estimerer, at 30 procent af vores proteiner er multifunktionelle schweizerknive.

”Det er med andre ord ikke et lille kuriøst hjørne af vores biologi, men en meget stor og betydningsfuld blok,” siger Birthe B. Kragelund.

Kendte proteiner er faktisk IDP’er

Hvis vi skal kigge på, hvor IDP’erne spiller en rolle i det at være menneske, kan man indledningsvis pege på hele transskriptionen.

Når DNA skal oversættes til funktionelle proteiner, sættes et stort molekylært maskineri i gang, og det består i et bredt omfang af proteiner uden fast struktur. Selv de proteiner, der holder vores DNA pakket sammen, de såkaldte histonproteiner, har uordnede regioner.

”Der er vi stadig i gang med at finde ud af, hvorfor netop transskriptionen indeholder så mange IDP’er, og hvorfor det er vigtigt,” siger Birthe B. Kragelund.

Et andet sted, hvor IDP’erne spiller en stor rolle, er i relation til biologiske membraner.

Membranproteinkomplekser består for manges vedkommende af et protein med fast struktur på celleoverfladen, der kan vekselvirke med signalmolekyler fra omgivelserne. Den del af proteinet, som går ned gennem membranen, er også fast i sin struktur, men til gengæld er den del af proteinet, som sidder inde i cellen, ofte helt eller delvist en ustruktureret IDP.

Nogle af de bedste eksempler på ovenstående er væksthormonreceptoren, der fortæller celler, om det er tid til at vokse eller ej, eller prolaktinreceptoren, som er vigtig for udvikling af brystvævet og mælkeproduktionen under en graviditet og efter fødslen.

”Vi overlader på den måde nogle helt essentielle funktioner til IDP’erne, og vi gør det nok af en årsag, som vi ikke har overblikket over endnu,” siger Birthe B. Kragelund.

Kemiske modifikationer giver proteiner varieret funktionalitet

En ledetråd til en større forståelse kan ligge i den måde, som IDP’ernes funktionalitet bliver reguleret i cellerne.

Forskning har vist, at de uordnede proteiner meget ofte er stramt reguleret gennem kemiske modifikationer, blandt andet fosforyleringer og metyleringer.

Fosforyleringer og metyleringer er meget simpelt fosfor- og metylgrupper, der klistres fast på et protein for at styre dets funktionalitet.

Man kan normalt betragte fosforyleringerne og metyleringerne som proteinets tænd- og slukknapper, men i IDP’erne kan de også virke som gearbokse.

Fosforylering kan som eksempel lukke ned for et aktivt område af proteinet eller tænde for det, så proteinet kan binde til givne stoffer eller andre proteiner, men for IDP’erne kan der være mange flere fosforyleringssteder og dermed flere gear.

”Det må være meget stramt reguleret, så man ikke får misinformation eller missignalering inde i cellerne. Men det gør også IDP’erne multivalente, så det samme protein kan tjene mange forskellige funktioner afhængigt af niveauerne af fosforylering eller metylering,” siger Birthe B. Kragelund.

Mange kræftformer skyldes mutationer i en IDP

Et interessant eksempel på et multifunktionelt IDP er cancerproteinet p53. P53 indeholder lange, uordnede områder, og i disse findes flere små ustrukturerede bindingsområder, og kun én af dem kan lave forskellige strukturer, afhængigt af hvilken af mange partnere, det binder til.

Der skal derfor ikke meget fantasi til at forestille sig, at forskning i IDP’er meget vel kan få klinisk relevans. Birthe B. Kragelund fortæller da også, at mange kræftformer skyldes mutationer i netop de uordnede dele af p53.

Mutationer i de uordnede regioner af BRCA2-proteinet kan som et andet eksempel lede til udvikling af brystkræft. Mutationer i andre dele af forskellige intracellulære IDP’er er også koblet sammen med udvikling af brystkræft.

Mutationer i et væksthormonreceptorproteins ustrukturerede regioner kan også skabe uoverskuelige helbredsmæssige problemer og lede til udvikling af kræft. Normalt binder et protein til væksthormonreceptoren og signalerer, at det skal sendes til nedbrydning, så cellerne ikke vokser i de perioder, hvor der ikke er behov for det.

En mutation i receptoren gør dog, at der ændres på dynamikken af den uordnede region, sådan at signalmolekylerne ikke kan binde til receptoren, og så signalerer væksthormonreceptoren fortsat vækst, hvilket er et af de tydelige kendetegn ved kræft. Forskning har vist, at det kan føre til udvikling af lungekræft.

Det hele skal dog ikke handle om kræft. Neurodegenerative sygdomme som Alzheimers og Parkinsons kan også relateres til problemer med IDP’er. For Alzheimers gælder det blandt andet, at ophobning af amyloid beta er et kendetegn ved udvikling af sygdommen og for Parkinsons er det proteinet α-synuclein. Begge disse proteiner er uordnede IDP’er.

”Rigtig mange sygdomme skyldes mutationer i uordnede proteiner eller fejl i uordnede dele af vores proteiner. Men det er naturligvis svært at udvikle medicin mod sygdommene, hvis man indledningsvist slet ikke ved, hvordan proteinerne opfører sig; man har ikke en lås til at blokere med en hæmmer,” siger Birthe B. Kragelund.

Spiller stor rolle i afkodning af arvemassen

Forskning i IDP’er er selvsagt et omfattende område, da det berører omkring 30 procent af alle vores proteiner. Derfor har Birthe B. Kragelund valgt nogle fokusområder at slå ned på.

Et af disse fokusområder er de proteiner, som er medvirkende i forbindelse med oversættelsen af arvemassen til funktionelt protein.

Arvemassens DNA er viklet omkring store proteinkomplekser, hvori histoner indgår, og histoner og DNA holdes sammen af linker histon 1-proteinet.

Når arvematerialet er viklet tæt sammen om histonerne, kan cellernes genetiske apparat ikke nemt tilgå arvemassen, og så bliver der ikke udtrykt proteiner.

Cellen har dog flere muligheder for at åbne for udtrykket af proteiner. En af disse muligheder er, at en lille IDP, prothymosin alfa, kan trække linker histon 1 væk fra nukleosomet og dermed øge tilgængeligheden til DNA’et.

Linker histon 1 har en meget lang hale af uorden og er ekstremt positivt ladet, mens prothymosin alfa er fuldstændigt ustruktureret og ekstremt negativt ladet.

Forskning fra Birthe B. Kragelunds gruppe og hendes samarbejdspartnere viser, at prothymosin alfa og histon 1 binder til hinanden med ekstrem affinitet, men fastholder uorden mens de er bundet.

”Sammen med vores samarbejdspartnere i Schweiz og USA publicerede vi vores resultater i Nature i 2018, og de viste, at begge proteiner forbliver helt ustrukturerede og uordnede, selv når de sidder sammen i et tæt kompleks. Vi har desuden lavet nogle videre analyser, der viser, at for at kunne slippe hinanden igen benytter de ustrukturerede proteiner sig af det, som hedder konkurrerende substitution, hvor to prothymosin alfa veksler mellem at binde til ét histon 1-protein. Det er en måde at regulere bindingen på, og den er vigtig at have for øje, hvis man vil forstå de komplekse interaktioner mellem proteiner i forbindelse med translationen,” forklarer Birthe B. Kragelund.

Skal udvikle nye teknikker til at studere IDP’er

Overordnet set kan Birthe B. Kragelunds forskning deles op i tre dele:

• Dynamiske og højtladede proteinkomplekser og deres regulering.

• IDP’ernes rolle i forbindelse med transskriptionen, hvor DNA bliver oversat til først RNA og sidenhen til proteiner.

• Betydningen af uordnede regioner i membranproteiner.

For at studere IDP’ernes rolle benytter forskerne sig af NMR-spektroskopi, hvor de ved at udnytte isotoper af forskellige atomkerner kan visualisere proteinerne og på den måde se, om de er strukturerede eller ikke-strukturerede og samtidig følge deres dynamik. Med andre ord kan de følge proteinernes dans.

Det kan forskerne gøre med proteinerne, både når de er alene og ikke danner komplekser med andre, men også når de interagerer og udfører deres funktion.

NMR-spektroskopi har vist sig at være et uvurderligt værktøj til studier af IDP’er, men der skal i forbindelse med forskningsprojektet også optimeres og udvikles nye eksperimenter til at se på IDP’er, for at de kan give forskerne alle de svar, som de gerne vil have.

Et helt selvstændigt problem er, at forskerne ikke kan benytte sig af mange af de teknikker, som forskere normalt benytter til studier af proteiners struktur. Det drejer sig blandt andet om røntgenkrystallografi og cryo-EM, der begge kræver, at proteinerne er strukturerede, hvilket ikke er muligt med disse dynamiske, uordnede proteiner.

”Vi står overfor det problem, at vi skal illustrere noget, som ikke har en fast struktur, men som heller ikke er tilfældigt. Det vil vi bruge NMR-spektroskopi til, men også kombinere med andre metoder, blandt andet enkeltmolekyle-spektroskopi og computersimulationer, til at kunne vise og forstå, hvordan kæderne opfører sig både alene, og når de vekselvirker med andre proteiner,” siger Birthe B. Kragelund.

Vil udbygge Danmarks rolle som ledende nation i proteinforskning

Forskningsarbejdet er sat til at vare i sammenlagt seks år, og ved enden af projektet håber Birthe B. Kragelund på, at forskerne har fået så god en forståelse af mekanismerne bag funktionaliteten af IDP’erne, at de også kan se, hvad der går galt, når det går galt.

Det helt lange perspektiv er, at der i forbindelse med sygdomme kan udvikles lægemidler, hvor den viden, som forskerne er kommet frem til, bliver inddraget i lægemiddeludviklingen.

Det kan være, at nogle lægemidler kan målrettes IDP’erne selv, mens andre kan stille et stillads op omkring de proteinkomplekser, som IDP’erne danner bindinger med.

”Vi skal ikke selv lave lægemiddeludvikling, men vi skal skabe et fundament, som de, der laver lægemidler, kan stå på, når de skal kæmpe mod sygdomme, der skyldes fejl i IDP’er,” siger Birthe B. Kragelund.

Den danske forsker tilføjer, at forskningen også etablerer Danmark som en førende spiller inden for forskningsfeltet, der fremadrettet vil få mere og mere opmærksomhed.

”I og med at vi i Danmark nu har et stort forskningsfelt inden for området, vil vi uundgåeligt uddanne en masse dygtige forskere, som kan sætte deres præg på dagsordenen i ikke bare Danmark, men også internationalt. De studerende, som vi uddanner lige nu, får en viden og nogle kompetencer, som de ikke kan få ved blot at læse lærebøgerne. Først for omkring fem år siden kom IDP’erne med med én enkelt side i den store molekylærbiologiske lærebog til universiteterne, og det er jo bemærkelsesværdigt lidt, når man nu tænker på, at IDP’erne udgør 30 til 40 procent af alle vores proteiner. Det her forskningsprojekt giver os muligheden for at sætte et stort aftryk på forskningen, fordi vi med en stor bevilling kan opnå kritisk masse til at rykke ved tingene,” siger Birthe B. Kragelund.

Birthe B. Kragelund modtog i 2018 en  Novo Nordisk Foundation Challenge Programme-bevilling til projektet “REPIN - Rethinking Protein Interactions”.