Små proteiner designet fra bunden kan tænde og slukke for vigtige signaler i kroppen

Næsten hver eneste celle i kroppen har molekylære kontakter, der reagerer på hormoner, neurotransmittere og andre signaler. Disse G-proteinkoblede receptorer, eller GPCR’er, er blandt medicinens vigtigste mål for lægemidler – men de er usædvanligt svære at styre, fordi det ikke er nok blot at binde sig til receptoren.

“Den analogi med låsen og nøglen passer meget godt til rigtig mange proteiner. Hvis du bare skal lave et protein, der blokerer et andet protein, så skal det binde, og så er du færdig. Men her er det mere som en kontakt, man skal kunne tænde og slukke – og faktisk er det lidt mere sofistikeret end det, fordi signalet også kan skrues lidt op eller ned. Det afhænger af receptoren og den sygdom, man gerne vil behandle,” siger Christoffer Norn, medstifter og CEO i Skape Bio og tidligere seniorforsker ved BioInnovation Institute i København.

Norn og et internationalt forskerhold har nu designet miniproteiner, der kan aktivere eller hæmme 11 forskellige GPCR’er, som er involveret i blandt andet kløe, smerte, migræne, stofskifte og kræft. Og forskerne stoppede ikke ved forsøg i celler: Hos mus mobiliserede et miniprotein rettet mod CXCR4 bloddannende stamceller i omtrent samme omfang som det godkendte lægemiddel plerixafor, men med færre uønskede ændringer i de cirkulerende blodceller.

Hvorfor nogle af medicinens vigtigste lægemiddelmål er så svære at styre

GPCR’er udgør den største og mest mangfoldige familie af membranreceptorer i det menneskelige genom. De sidder i cellemembranen og omsætter signaler udefra til ændringer inde i cellen. På den måde er de med til at regulere processer, der spiller en rolle i alt fra hjerte-kar-sygdomme og stofskifte til kræft og sygdomme i nervesystemet.

“Omkring en tredjedel af al medicin på markedet rammer GPCR’er. Det betyder selvfølgelig, at de er rigtig gode lægemiddelmål. De har tit en rigtig stor fysiologisk effekt, hvis man rammer dem,” siger Christoffer Norn.

Forskere har derfor i årtier forsøgt at udvikle små molekyler, peptider, antistoffer og andre biologiske lægemidler, der kan påvirke de enkelte GPCR’er.

Med de novo-design er udgangspunktet et andet. I stedet for at tage noget, naturen allerede har skabt, og forsøge at tilpasse det, kan forskerne begynde med den ønskede interaktion og derfra beregne, hvilket protein der skal bygges.

Norn oplevede selv den voldsomme udvikling inden for computerbaseret proteindesign under sine tre år som postdoc i David Bakers laboratorium ved University of Washington. Baker modtog senere halvdelen af Nobelprisen i kemi i 2024 for computerbaseret proteindesign.

“For ti år siden kunne man inden for proteindesign spørge: Hvad sker der, hvis man udskifter én aminosyre med en anden? Men mod slutningen af min tid hos David kunne vi designe helt nye proteiner fra bunden, og de strukturer, vi bagefter målte, kunne nogle gange ligge næsten inden for diameteren af et atom fra computermodellen. Præcisionen var blevet en helt anden,” siger Christoffer Norn.

Netop det spring i præcision blev afgørende for GPCR-projektet. Her er det nemlig ikke nok at designe et protein, der nogenlunde passer til receptoren. Proteinet skal også stabilisere receptoren på den helt rigtige måde og dermed være med til at bestemme, hvordan signalet sendes gennem cellemembranen.

Små proteiner skal kunne mere end bare binde

I undersøgelsen fokuserede forskerne på miniproteiner. Små proteiner og peptider findes allerede overalt i biologien – insulin og GLP-1 er omtrent i samme størrelsesorden – men her bliver hele molekylet designet fra bunden til én bestemt receptor.

“Et miniprotein er måske kun 40–70 aminosyrer langt. Forskellen er, at vi ikke tager noget, naturen allerede har lavet, og tilpasser det. Vi designer hele proteinet de novo til den receptor, vi gerne vil styre,” siger Christoffer Norn.

Den lille størrelse giver samtidig forskerne stor frihed til at bygge andre egenskaber ind i molekylet.

“De er modulære. Man kan have ét domæne, der binder til receptoren og giver den funktion, man ønsker, og så et andet domæne, der forlænger halveringstiden eller hjælper med at transportere proteinet et bestemt sted hen. Fordi vi designer dem helt fra bunden, kan vi i høj grad selv bestemme, hvor de forskellige funktioner skal bygges ind,” siger Christoffer Norn.

Men at designe proteinerne var kun halvdelen af udfordringen. Forskerne havde også brug for en måde at teste meget store mængder kandidater eksperimentelt – uden først at tage de vanskelige receptorer ud af deres naturlige miljø i cellemembranen.

Proteiner designet til at nå dybt ned i receptorens bindingslomme

Forskerne brugte to forskellige, men supplerende beregningsstrategier. Med RFdiffusion udpegede de vigtige kontaktpunkter på receptoren og byggede derefter et helt nyt protein op omkring dem. Når bindingslommen lå særligt dybt, begyndte de med et lille motiv på fem aminosyrer, der kunne nå ind til det ønskede punkt, og byggede derefter resten af miniproteinet omkring denne kontakt.

“Hos nogle af receptorerne er der et bestemt punkt dybt inde i bindingslommen, som man skal ramme. Så kan vi først designe et meget lille stykke, der laver den kontakt, og derefter bygge resten af proteinet omkring det,” siger Christoffer Norn.

Den anden tilgang, MetaGen, fungerede anderledes. Her begyndte forskerne ikke med en helt ny struktur, men søgte blandt næsten 9.000 proteinskeletter, der var udvalgt blandt hundreder af millioner af AlphaFold-forudsagte proteinstrukturer, efter former, der kunne tilpasses receptoren.

“Det smarte er den enorme mangfoldighed af former, der allerede findes i det forudsagte proteinunivers. Man kan finde knækkede helixer, løkker, der stikker ud på mærkelige måder, og mange andre geometrier, som man sjældent ville se i et almindeligt proteinbibliotek. De kan give os helt nye udgangspunkter for design,” siger Christoffer Norn.

Sådan testes receptorerne uden at tage dem ud af cellen

GPCR’er er samtidig vanskelige at screene eksperimentelt, fordi de sidder i cellemembranen. Ved traditionel screening er man derfor ofte nødt til først at tage receptoren ud af membranen og stabilisere den ved hjælp af eksempelvis detergent, liposomer eller kunstige membranskiver. Problemet er, at receptoren kan ændre opførsel, når den fjernes fra sit naturlige miljø.

“Normalt er de her G-proteinkoblede receptorer enormt svære at håndtere eksperimentelt, fordi de sidder midt i membranen. Folk har fundet på alle mulige tricks for at gøre dem opløselige, men så har man ikke rigtig receptoren i dens naturlige miljø mere. Og så kan de bindere, man finder, ende med ikke at virke, når man går tilbage til det naturlige miljø,” siger Christoffer Norn.

Forskerne udviklede derfor en metode kaldet receptor diversion, hvor receptoren bliver inde i en menneskecelle. Hvert kandidat-miniprotein får en lille sekvens, der holder det tilbage i cellens sekretoriske system. Hvis miniproteinet ikke binder receptoren, fortsætter receptoren ud mod celleoverfladen. Hvis det derimod binder, bliver receptoren holdt tilbage sammen med miniproteinet.

Begge er mærket med fluorescerende markører.

“Det er sådan lidt lyskrydsagtigt: Hvis det røde miniprotein og den grønne receptor holder sig adskilt, så binder designet ikke. Men hvis de overlapper, får man gult – og så ved vi, at miniproteinet har fanget receptoren,” siger Christoffer Norn.

Fra et farvesignal til screening af 100.000 proteindesign

Det viste sig, at farvesignalet kunne fortælle forskerne mere end blot, om et miniprotein bandt. Jo større overlap der var mellem det røde og grønne signal, desto stærkere var bindingen. Da forskerne sammenlignede metoden med bindere, hvor bindingsstyrken var målt uafhængigt, stemte resultaterne godt overens.

“Det helt fantastiske, som vi ikke havde forestillet os til at starte med, var, at det også kunne blive kvantitativt. Når vi måler, hvor meget det røde og det grønne overlapper i hele cellen, kan vi lave det om til et tal, og det korrelerer med, hvor stærkt designet rent faktisk binder,” siger Christoffer Norn.

For at skalere metoden op koblede forskerne hvert miniprotein til en unik DNA-stregkode. Op mod 100.000 forskellige proteindesign blev fordelt på omkring 10 millioner celler. Først tog forskerne billeder af cellerne og målte farvesignalet. Derefter aflæste de DNA-stregkoden direkte i de samme mikroskopplader og kunne dermed koble signalet i hver celle til det konkrete proteindesign.

“Vi kigger på omkring 10 millioner celler, og så læser vi stregkoden én base ad gangen. På den måde kan vi finde ud af, hvilket design der sidder i hvilken celle. Det betyder, at vi kan screene meget store biblioteker, uden at vi nogensinde behøver at tage receptoren ud af membranen,” siger Christoffer Norn.

De mest lovende kandidater blev derefter oprenset og undersøgt nærmere for både funktion og struktur.

Først skulle forskerne afgøre, om proteinet faktisk bandt til receptoren. Derefter kom det afgørende spørgsmål: Kunne det også ændre receptorens signalering? For nogle af designene brugte forskerne desuden kryoelektronmikroskopi, cryo-EM, til at undersøge, om den struktur, de havde designet på computeren, også var den struktur, de endte med at fremstille.

Designede proteiner kunne skrue signaleringen op og ned i 11 receptorer

Tilgangen gav funktionelle miniproteiner mod 11 forskellige GPCR’er, der blandt andet er involveret i kløe, smerte, migræne, stofskifte, kræft og reproduktion. Nogle fungerede som agonister og aktiverede receptoren, mens andre fungerede som antagonister og blokerede signaleringen.

Det afgørende var dermed ikke blot, at forskerne kunne få ét enkelt design til at virke. Metoderne fungerede på tværs af meget forskellige GPCR’er og kunne skabe både proteiner, der tændte signaleringen, og proteiner, der slukkede den – et vigtigt tegn på, at der kan være tale om en bredere platform og ikke blot en løsning til én enkelt receptor.

For den kløe- og smerterelaterede receptor MRGPRX1 fandt forskerne flere agonister. En af dem blev efterfølgende optimeret ved hjælp af computermodeller, så dens styrke steg omkring 12 gange. Den kunne aktivere receptoren ved nanomolære koncentrationer og viste kun begrænset aktivitet på andre receptorer, da den blev testet mod 318 GPCR’er.

Forskerne designede også 20 agonister mod NK1R, hvoraf den stærkeste virkede ved omkring én nanomolar, samt antagonister mod blandt andet CXCR4, CCR5, oxytocinreceptoren og flere receptorer med betydning for stofskifte og migræne. En antagonist mod PTH1R kunne hæmme signaleringen ved omkring 450 picomolar.

“Direkte ud af computeren kan vi allerede få meget stærk binding – i nogle tilfælde helt ned i det picomolære område. Det er noget af det, der gør miniproteinerne attraktive. Man kan starte med et meget kompakt molekyle og så optimere de egenskaber, man har brug for,” siger Christoffer Norn.

Kryoelektronmikroskopi viste samtidig, hvor præcist de designede strukturer svarede til de proteiner, forskerne faktisk fremstillede. For to agonister mod MRGPRX1 afveg de eksperimentelt bestemte proteinstrukturer kun omkring 0,7 ångström fra computermodellerne – mindre end bredden af et typisk atom.

“Med de her G-proteinkoblede receptorer har man virkelig brug for den præcision. Det er ikke nok bare at lave et protein, der folder nogenlunde rigtigt. Det skal også være med til at bestemme, hvordan receptoren signalerer gennem membranen,” siger Christoffer Norn.

Fra computermodel til virkelig struktur. Det turkise miniprotein er designet til at binde den guldfarvede receptor MRGPRX1. Da forskerne bestemte strukturen eksperimentelt, lå den meget tæt på den struktur, computeren havde forudsagt.

Et designet protein virker efter hensigten hos mus

Den afgørende test uden for cellerne var rettet mod CXCR4, som normalt er med til at holde bloddannende stam- og progenitorceller tilbage i knoglemarven. Blokerer man receptoren, frigives cellerne til blodbanen, hvorfra de kan opsamles til blandt andet stamcelletransplantation.

Hos mus mobiliserede den designede antagonist dCX1_001 stam- og progenitorcellerne i omtrent samme omfang som plerixafor, et godkendt lægemiddel, der blokerer CXCR4 og bruges ved visse former for blodkræft. Samtidig gav dCX1_001 en mindre stigning i andre cirkulerende hvide blodlegemer og førte ikke til de samme uønskede ændringer i blodcelletal eller forhøjede niveauer af systemiske cytokiner som sammenligningsbehandlingen.

Forskerne brugte derefter et system til genoverførsel og fandt efterfølgende både genetisk modificerede celler og vektor-DNA i bloddannende væv. Det viste, at de mobiliserede stam- og progenitorceller kunne vende tilbage til de bloddannende væv og etablere sig igen.

“Det betyder ikke, at vi har et lægemiddel. Det her er stadig præklinisk. Men det er et vigtigt skridt, fordi vi ikke længere bare viser, at et designet protein kan binde til en receptor i et celleforsøg. Vi kan give det til et dyr og se den biologiske effekt, som vi har designet det til at frembringe,” siger Christoffer Norn.

Fra lægemiddelmål til ukendt biologi

Den næste udfordring er at gøre lovende bindere til molekyler, der kan klare den langt længere vej frem mod et lægemiddel. Små miniproteiner forsvinder hurtigt fra blodbanen, hvis man ikke gør noget ved dem, og derfor kan deres levetid i kroppen være nødt til at blive forlænget. I undersøgelsen havde et miniprotein rettet mod den migrænerelaterede CGRP-receptor en halveringstid på blot omkring 0,4 timer hos mus. Da forskerne koblede det til et Fc-domæne – en større komponent fra antistoffer – steg halveringstiden til omkring 25 timer.

“De er meget små, så hvis vi ikke gør noget ved dem, ryger de hurtigt ud af kroppen. Derfor skal man forlænge halveringstiden på forskellige måder. Det kan for eksempel være ved at sætte et andet domæne på eller lave en kemisk modifikation,” siger Christoffer Norn.

Fordi proteinerne designes helt fra bunden, kan forskerne også bygge andre egenskaber ind i dem. De kan blandt andet øge stabiliteten, indføre bestemte steder til kemiske modifikationer og potentielt fjerne sekvenser, der forventes at kunne udløse uønskede immunreaktioner.

“Det er en af fordelene ved, at vi designer dem helt de novo. Vi kan gøre dem meget stabile, og vi kan bygge funktionelle grupper ind præcis dér, hvor vi vil have dem. Så kan man begynde at spørge: Hvor skal molekylet hen, hvor længe skal det være i kroppen, og hvordan skal det komme ud igen?” siger Christoffer Norn.

De muligheder er dog stadig i høj grad mål for den videre udvikling og ikke noget, som denne undersøgelse i sig selv dokumenterer.

Holdet bag Skape Bio arbejder videre med at udvikle de designede miniproteiner og undersøge, om teknologien kan bruges både som udgangspunkt for nye lægemidler og som værktøj til at forstå receptorer, hvis biologi stadig er dårligt kendt.

Det kan forskerne stadig ikke designe sig til

Der er nemlig stadig en mere grundlæggende begrænsning. Forskerne bliver stadig bedre til at bestemme, hvor og hvordan et miniprotein skal binde til en receptor. Men de kan endnu ikke sikkert forudsige, hvad bindingen får receptoren til at gøre. Et protein designet til en receptorstruktur, der ser aktiv ud, bliver ikke nødvendigvis en agonist, og et protein rettet mod en tilsyneladende inaktiv struktur bliver ikke automatisk en antagonist.

“Vi kan efterhånden være rigtig gode til at spørge: Kan vi lave noget, der binder lige her? Det sværere spørgsmål er, hvad der så sker med receptoren. Det er jo ikke bare en kontakt, der enten er tændt eller slukket. Signalet kan være skruet mere eller mindre op, og receptoren kan signalere på forskellige måder. Det er den del, vi stadig skal forstå meget bedre,” siger Christoffer Norn.

Undersøgelsen fokuserede samtidig bevidst på GPCR’er med forholdsvis tilgængelige bindingslommer. Mange andre receptorer – især dem, der normalt binder små molekyler – har bindingssteder, som ligger dybere begravet i membranen og derfor er langt vanskeligere for et protein at nå.

Netop nogle af de mest interessante GPCR’er er såkaldte orphan-receptorer, hvis biologi stadig er dårligt forstået. Flere af dem har stærke genetiske forbindelser til fedme, immunrelaterede sygdomme og andre lidelser. Det peger på, at de kan være interessante lægemiddelmål, selv om forskerne stadig mangler gode måder at styre dem eksperimentelt på.

“Nogle gange giver genetiske studier af mennesker os et meget stærkt fingerpeg om, at det kan have betydning for sygdom at ændre aktiviteten af en receptor. Men genetikken fortæller os, hvad der sker, når receptorens funktion er ændret gennem et helt liv. Den fortæller os ikke nødvendigvis, hvad der sker, hvis vi midlertidigt aktiverer eller hæmmer receptoren med et lægemiddel. Til det har vi brug for molekyler, som gør det muligt at manipulere receptorerne eksperimentelt,” siger Christoffer Norn.

Værktøjet kan komme før naturens eget signal

Det kan vende den normale rækkefølge i forskningen på hovedet. Hvis forskerne kender en receptors struktur – eller kan forudsige den – kan de i princippet designe et molekyle, der påvirker receptoren, før nogen overhovedet har fundet dens naturlige ligand.

“Det er noget af det, jeg synes er virkelig spændende. Nu har vi AlphaFold, så vi kan se strukturerne, og vi har algoritmer, der kan generere bindere ud fra strukturen alene. Så i stedet for at vente på, at nogen finder den naturlige ligand, kan vi måske selv lave et værktøj og begynde at spørge: Hvad er det egentlig, den her receptor gør?” siger Christoffer Norn.

Svaret kan pege på et nyt lægemiddelmål – eller vise, at det genetiske spor ikke fører til noget, der kan bruges i behandling. Begge dele vil give forskerne adgang til en biologi, som i dag stadig er næsten utilgængelig.

Idéen opstod under Norns postdoc hos David Baker og blev senere videreudviklet gennem BioInnovation Institute. I dag udgør den det videnskabelige grundlag for Skape Bio, som Norn var med til at stifte.

“Det første, vi skal vise, er, om vi kan tage molekyler fra denne tilgang videre mod klinikken. Men der er også et andet spor. For de receptorer, hvor vi næsten ikke kender biologien, kan det designede protein i sig selv blive værktøjet, der gør, at vi kan finde ud af, hvad receptoren egentlig gør. Og det kan i sidste ende pege på helt nye lægemiddelmål,” siger Christoffer Norn.

Vejen fra en computermodel til et lægemiddel er stadig lang, og ingen af miniproteinerne i undersøgelsen er endnu blevet testet på mennesker. Men udgangspunktet har ændret sig markant. Forskerne behøver ikke længere kun at vente på, at naturen – eller enorme screeningsbiblioteker – leverer et molekyle, der kan styre en receptor. I stigende grad kan de begynde med selve receptoren og forsøge at designe præcis det molekyle, de har brug for.