Nyt lægemiddelmål kan bane vej for den første behandling af dødelig børnesygdom

Celler nedbryder rutinemæssigt gamle eller beskadigede mitokondrier, som omdanner næringsstoffer til ATP – den energi, cellerne bruger til at fungere. Normalt beskytter denne genbrugsproces - i fagsprog mitofagi - cellerne. Men ved FBXL4-relateret mitokondrie-DNA-depletionssyndrom bliver processen ødelæggende: Cellerne fjerner mitokondrier, der stadig kan producere energi, og efterlader hjernen, musklerne, leveren og andre energikrævende organer med for lidt kraft.

På verdensplan er der rapporteret om mere end 100 mennesker med sygdomsfremkaldende varianter i FBXL4, og tidligere kliniske studier har anslået medianalderen ved død til omkring 3 år. Symptomerne viser sig ofte allerede i spædbarnsalderen og kan omfatte alvorligt forsinket udvikling, nedsat muskelspænding, spisevanskeligheder, skader på hjernen og leveren samt metabolisk acidose, hvor syre ophobes i kroppen. Der findes i dag ingen behandling, der kan ændre sygdommens forløb.

“Vi fandt en grundlæggende forskel mellem de forskellige former for mitofagi. Den ene retter sig mod beskadigede mitokondrier, mens mitokondrierne i NIX–BNIP3-signalvejen stadig havde funktionel kapacitet – de kunne optage ilt og potentielt danne ATP,” siger Ian Ganley, professor i cellulær homeostase ved University of Dundee og forskningsleder ved MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit.

Ganley og hans kolleger havde desuden opdaget, at AMPK fungerer som cellens brændstofmåler og regulerer de to signalveje i hver sin retning.

“Når energiniveauet er lavt, giver det mening at øge udskiftningen af dysfunktionelle mitokondrier, fordi de ikke virker. Men samtidig giver det mening at bremse udskiftningen af de funktionelle mitokondrier, fordi de stadig kan producere ATP. Det, vi har fundet, er, at AMPK gør netop det,” siger Ian Ganley.

Forsøgene er stadig prækliniske og viser ikke, at AMPK-aktivatorer kan hjælpe børn med sygdommen. Men de peger på en konkret fejl i cellerne, som lægemiddellignende stoffer muligvis kan rette op på – og dermed på en mulig vej mod den første målrettede behandling.

Når mitokondriegenbruget tager overhånd

Ian Ganleys laboratorium forsker i mitofagi, den særlige form for cellulær genbrug, hvor mitokondrier transporteres til lysosomer og nedbrydes. En stor del af forskningen på området har fokuseret på PINK1–Parkin-signalvejen, som mærker beskadigede mitokondrier til fjernelse, og som er forstyrret i visse arvelige former for tidligt debuterende Parkinsons sygdom.

“Mitofagi er blevet knyttet til Parkinsons sygdom, fordi det giver mening, at beskadigede mitokondrier kan ophobes og skabe problemer, hvis de ikke bliver fjernet. ATP-produktionen falder, mængden af reaktive iltforbindelser kan stige, og det kan bidrage til sygdommen,” siger Ian Ganley.

Men mitofagi er ikke én enkelt signalvej med ét enkelt formål. Ganleys gruppe blev interesseret i en anden vej, der styres af de mitokondrielle proteiner NIX og BNIP3.

“Det var en grundlæggende forskel. I PINK1–Parkin-vejen var mitokondrierne beskadigede og dysfunktionelle. I NIX–BNIP3-vejen bevarede de derimod deres funktionsevne. Vi vidste ikke, om de var helt normale, men de kunne optage ilt og potentielt danne ATP,” siger Ian Ganley.

Samtidig viste andre studier, hvordan varianter i FBXL4 forårsager mitokondrie-DNA-depletionssyndrom 13, også kendt som MTDPS13.

“Normalt holder FBXL4 aktiviteten i denne mitofagiske signalvej på et meget lavt niveau. Men hos patienter med mutationer i genet ophobes NIX og BNIP3 langsomt på mitokondrierne. På et tidspunkt udløser de mitofagi, så mitokondrierne bliver nedbrudt,” siger Ian Ganley.

I raske celler fungerer FBXL4 som en bremse ved at mærke NIX og BNIP3 til nedbrydning, før de når at ophobes. Uden et funktionsdygtigt FBXL4 samler proteinerne sig på mitokondrierne, indtil de sender signal om, at strukturerne skal nedbrydes.

Et lykketræf peger på en mulig behandling

Resultatet er et alvorligt tab af mitokondrier. Ganleys gruppe havde imidlertid kort forinden opdaget, at AMPK regulerer de to signalveje i hver sin retning: Under energimangel forstærker AMPK PINK1–Parkin-vejen, mens den hæmmer NIX–BNIP3-vejen.

“Vi fandt ud af, at AMPK fremmer mitofagi af dysfunktionelle mitokondrier, men hæmmer mitofagi af funktionelle mitokondrier. PINK1–Parkin-vejen bliver altså forstærket, mens NIX–BNIP3-vejen bliver blokeret. Det er en måde, hvorpå cellen afbalancerer de to signalveje,” siger Ian Ganley.

De to fund passede sammen. Den signalvej, der tømmer cellerne for mitokondrier ved MTDPS13, var samtidig den signalvej, som AMPK kunne bremse.

“Vi havde hele tiden tænkt over, hvordan man kunne styrke mitofagi for at behandle sygdomme. Så fandt vi en måde at hæmme en helt bestemt mitofagi-signalvej på, og samtidig viste det sig, at netop denne signalvej er overaktiv i den sjældne sygdom. Det var lidt af et lykketræf: Vi arbejdede med dette, samtidig med at de andre opdagelser blev gjort, og pludselig passede det sammen med det, vi selv var i gang med,” siger Ian Ganley.

AMPK bliver sat på prøve

Forskerne testede aktivering af AMPK i genetisk modificerede menneskeceller, hudceller fra personer med MTDPS13 og en musemodel, der efterligner dele af den celleskade, som tabet af FBXL4 forårsager.

“Vores første strategi var at tage patientceller, hvor vi ved, at denne form for mitofagi er overaktiv, og behandle dem med AMPK-aktivatorer for at se, om vi kunne bringe mitofagien tilbage på et normalt niveau,” siger Ian Ganley.

Forskerne begyndte med at inaktivere FBXL4 i menneskeceller og behandle dem med den direkte AMPK-aktivator MK-8722. Derefter gentog de forsøgene i celler uden aktiv AMPK for at fastslå, om en eventuel genopretning faktisk afhang af enzymet.

Forskerholdet brugte derefter en fluorescerende markør kaldet mito-QC til at følge mitofagien direkte. Markøren farver mitokondrierne med to farver, men det ene signal forsvinder i det sure miljø i et lysosom. Den farve, der bliver tilbage, afslører derfor, hvilke mitokondrier der er endt i cellens nedbrydningssystem.

“Vi ønskede ikke at basere os på ét enkelt stof eller én enkelt måling. Vi brugte patientceller, genetisk modificerede celler, forskellige AMPK-aktivatorer og direkte målinger af mitofagi for at undersøge, om signalvejen virkelig blev reguleret,” siger Ian Ganley.

Den samme mekanisme viser sig i celler og mus

Forskerne gentog forsøgene med de direkte AMPK-aktivatorer PXL-770 og BI-9774 og målte mitokondrielle proteiner, iltforbrug og ATP-produktion. Derefter undersøgte de fibroblaster fra personer med MTDPS13 for at fastslå, om mekanismen også gjorde sig gældende i celler med sygdomsfremkaldende varianter.

Til sidst anvendte de en kemisk fremkaldt musemodel, fordi mus, der helt mangler FBXL4, dør kort efter fødslen. Forskerholdet undersøgte mitofagi og mitokondrielle proteiner i leveren og hjernen efter 5 dages behandling og testede også metformin, som aktiverer AMPK indirekte og især virker i bestemte væv.

Tabet af FBXL4 fik NIX og BNIP3 til at ophobes, øgede mitofagien og reducerede mængden af mitokondrielle proteiner. MK-8722 modvirkede en stor del af dette tab, men kun når AMPK var aktiv. Mito-QC viste, at færre mitokondrier nåede ind i lysosomerne, mens det øgede iltforbrug viste, at de bevarede mitokondrier stadig kunne producere energi.

“Det bekræfter vores oprindelige idé om, at denne signalvej nedbryder funktionelle mitokondrier. Når vi blokerer den, genopretter vi mitokondriefunktionen,” siger Ian Ganley.

Patientceller genvinder en del af deres energiforsyning

Fibroblaster fra personer med MTDPS13 bragte forsøgene tættest på de børn, der lever med sygdommen. Sammenlignet med kontrolceller havde patientcellerne mere mitofagi og færre mitokondrier.

“Det vigtigste var, at mitokondriernes aktivitet og ATP-produktionen blev genoprettet. I patientcellerne, hvor mitofagien er øget, er der færre mitokondrier, og deres aktivitet er meget lav. Aktivering af AMPK blokerede denne signalvej og genoprettede en del af funktionen,” siger Ian Ganley.

I den kemisk fremkaldte musemodel reducerede aktivering af AMPK den overdrevne mitofagi i leveren og i visse neuroner i hippocampus. Metformin gav en lignende, men svagere effekt i leveren. Det støtter, at mekanismen virker, men peger ikke på metformin som en oplagt behandling.

“Metformin gav en lignende effekt i dyremodellen, men stoffet er langt mindre potent og virker meget vævsspecifikt. De andre AMPK-aktivatorer er som regel mindre vævsspecifikke,” siger Ian Ganley.

Musene havde ikke sygdomsfremkaldende varianter i FBXL4, og forsøgene strakte sig kun over kort tid. Alligevel pegede de genetisk modificerede celler, patientcellerne og det levende væv i samme retning: Når NIX–BNIP3-mitofagien blev hæmmet, blev mitokondrier, der stadig kunne producere energi, bevaret.

“Dyremodellen er ikke det samme som et barn med mutationer i FBXL4, men den gjorde det muligt at undersøge, om aktivering af AMPK kunne dæmpe den overdrevne mitofagi i organer, der er centrale for sygdommen,” siger Ian Ganley.

Fra reddede celler til en mulig behandling

Studiet viser ikke, at AMPK-aktivatorer kan lindre symptomer eller forlænge livet hos børn. Men lægemiddellignende stoffer rettede delvist op på den underliggende fejl i patientcellerne og påvirkede den samme signalvej i musenes lever og hjerne. PXL-770 har allerede været afprøvet i kliniske forsøg mod en anden sygdom, men er endnu ikke godkendt.

“Disse AMPK-aktivatorer er endnu ikke godkendt til klinisk brug, men nogle af dem bliver afprøvet i kliniske forsøg. En mulighed kunne være små studier, måske endda som forsøgsbehandling af humanitære grunde, fordi disse børn ofte dør meget tidligt. Vi ved det endnu ikke, men det kan være en mulig behandling af en sygdom, som i dag er uhelbredelig,” siger Ian Ganley.

Forskerne skal stadig afklare, om aktivering af AMPK kan forbedre symptomerne, organernes funktion eller overlevelsen, og om egnede stoffer kan nå frem til hjernen og andre berørte væv. En genetisk dyremodel ville også kunne give stærkere dokumentation.

Princippet kan muligvis række ud over denne sjældne sygdom. Forskningen i Parkinsons sygdom har især fokuseret på, hvad der sker, når cellerne ikke formår at fjerne defekte mitokondrier.

“Aktivering af AMPK bremser nedbrydningen af velfungerende mitokondrier og fremmer nedbrydningen af de defekte. Det er sandsynligvis også relevant for Parkinsons sygdom, hvor vi mener, at defekte mitokondrier ophobes. Det åbner for nye steder, hvor vi måske kan regulere balancen mellem nedbrydningen af dysfunktionelle og funktionelle mitokondrier,” siger Ian Ganley.

Det kan derfor være det forkerte mål blot at øge eller mindske mitofagien. Nøglen kan være at blokere den proces, der fjerner velfungerende mitokondrier, uden samtidig at forstyrre den proces, der rydder de beskadigede af vejen.

Ganley begyndte med at spørge, hvordan cellerne afgør, hvilke mitokondrier der skal fjernes. Det grundlæggende spørgsmål kan nu pege mod en behandling til børn, som i dag ikke har nogen.

“Det går virkelig op for en, at det arbejde, man udfører i laboratoriet, faktisk kan få klinisk betydning. Ofte tænker vi ikke sådan – vi tænker på mekanismer og celler i en petriskål. Men hvis det her kunne bruges som behandling, ville det være helt fantastisk,” siger Ian Ganley.