De utallige processer, der finder sted i vores krops celler, er grundlaget for livet, som vi kender det. Da cellerne er væskefyldte, skabte den britiske kemiker Carol Robinson stor opmærksomhed ved at undersøge livets processer i et vakuum. På trods af massiv modstand fortsatte hun. Nu modtager hun Novozymes-prisen for at skabe et helt nyt felt indenfor massespektrometri, hvor man også kan undersøge proteiners form, og hvordan de interagerer. I dag bruges denne teknik til at identificere helt nye mål for medicin.
Nogle af de vigtigste proteiner i vores krop findes på overfladen af alle celler. Membranproteinerne styrer transporten ind og ud af celler og er nøglen til, hvordan celler kommunikerer. Dette gør membranproteiner til meget vigtige lægemiddelmål. Da proteinerne naturligt findes i hydrofobe og vandskyende membraner, har forskere dog haft svært studere, hvordan proteinerne samles og interagerer med andre molekyler.
Carol Robinson modtager Novozymes-prisen 2019 for sine videnskabelige gennembrud og sit banebrydende arbejde med at bruge massespektrometri til analyse af bl.a. disse proteinkomplekser.
"Membranproteinerne er essentielle for kroppens funktioner, men er utroligt vanskelige at studere, fordi de er forankrede inde i membraner, hvor de sidder i en olieholdig fase. Det, vi gjorde, var at dække dem i detergent – dvs. nærmest inde i sæbeboble, som først springer, når de er kommet ind i selve massespektrometeret. På mirakuløs vis gør det, at de forbliver intakte i en foldet tilstand, så vi kan undersøge deres 3D-struktur, og hvordan de binder til andre proteiner og fedstoffer," forklarer Carol Robinson, professor ved Department of Chemistry,University of Oxford.
En usædvanlig vej til succes
Massespektrometri blev oprindeligt udviklet til bestemmelse af massen af små molekyler. I et massespektrometer ioniseres molekylerne og afbøjes i et magnetisk eller elektrisk felt under deres flyvning. Tunge molekyler bliver kun påvirket under deres passage gennem et spektrometer, mens lettere afbøjes mere. Ved at måle, hvor langt de molekylære ioner flyver, kan man derfor bestemme, hvor meget de vejer. Molekylerne sorteres ud fra forholdet mellem deres masse og ladning.
"Jeg bliver stadig lige fascineret over at se strålen af ioner flyve gennem et massespektrometer, når jeg tænker på, hvad man kan lære af spektrene. Et massespektrometri-spektrum er lidt som et sudoku: Du begynder med alle muligheder, og så finder du den eneste løsning på problemet. Det giver en stor tilfredsstillelse."
At Carol Robinson skulle ende med at blive den første kvindelige professor på University of Oxford, var nok ikke noget, man lige kunne have forudsagt, for hendes rejse har været ganske usædvanlig. Efter at have forladt skolen som 16-årig tog hun job som tekniker ved Pfizer Pharmaceuticals, hvor hun kom til at arbejde i massespektrometri-laboratoriet. En dag så en af Carols kolleger, at hun havde et særligt potentiale.
"De opfordrede mig til at tage syv års deltidsstudium på universitetet. Det var et langt, sejt træk, og derefter var jeg så heldig at blive optaget på University of Cambridge til at tage en ph.d. Traditionelt var massespektre brugt til at bestemme massen af molekyler. I mit ph.d.-projekt begyndte jeg at arbejde med, hvordan vi også kunne bruge massespektrometeret til at bestemme sekvensen af små fragmenter af et protein."
Molekylære elefanter med vinger
Da proteiner bygges af specifikke sekvenser af de 21 aminosyrer - 21 forskellige byggesten, alle med forskellige masser, formåede forskerne at lære at aflæse proteinsekvenserne ved at se på afstanden mellem toppene i spektrene. Carol Robinsons karriere var på rette spor, men så skete der noget.
"Jeg gjorde noget, der blev betragtet som meget usædvanligt: Jeg tog orlov fra min forskerkarriere i otte år, hvilket var meget utraditionelt på det tidspunkt.Jeg nød virkelig tiden hjemme med mine tre børn, men kom så tilbage til Oxford."
I en alder af 35 år vendte hun tilbage til videnskaben til en forskerstilling i massespektrometri i Chris Dobsons gruppe ved University of Oxford. Mens hun var væk, var der dog sket nogle revolutionære ting inderfor massespektrometri.
Jeg blev opfordret til at søge ind på det nye felt proteomik. Nu kiggede man pludselig ikke kun på peptider og sekventerede aminosyrerne langs de små kæder. Vi kiggede nu på hele proteiner, som var enorme, i hvert fald indenfor massespektrometrien.Selv om at molekylerne kan vejer et par hundrede massenheder (daltons), så vejer proteiner mellem 20.000 og 30.000 daltons.
"Udfordringen var, hvordan man får disse store molekyler til at flyve i massespektrometeret. John Fenn, en af mine store helte indenfor videnskabelige forskning, modtog en del af Nobelprisen for at opdage electrospray massespektrometri. Han udtrykte det ved at sige: ’Jeg gav molekylære elefanter vinger’."
Sprøjtemaler proteiner
Selv om John Fenn fik de meget store proteinmolekyler til at flyve, ønskede Carol Robinson mere - meget mere. Hun ønskede at bruge massespektrometeret til at bestemme proteiners form. Hun begyndte at arbejde på opgaven kort tid efter, at elektrospray-ioniseringsteknologien blev tilgængelig. Det gjorde det muligt at overføre intakte proteiner fra opløsning til vakuum.
Hun fik en skør ide: Hvis hun kunne sprøjtemale molekylerne, kunne hun adskille dem ud fra, hvor meget maling de var dækket af. Det endelige mål var at kunne følge proteiners foldning ved brug af massespektrometri.
"Hvis du skal sprøjtemale et ikke-foldet protein, er overfladen større, og det ville derfor kræve meget maling. Men hvis det er foldet til en meget kompakt struktur og derefter malet, bruger du meget mindre maling, og det er præcis det, vi gør: Vi sprøjter proteinet med deuterium, som vejer mere end brint. Hvis et område af et protein udfoldes, eksponeres hydrogenatomer og udveksles med deuterium. Men hvis det er tæt foldet, vil der ikke udveksles lige mange, så det vejer mindre."
Carol Robinson udviklede en hydrogen-deuterium-metode, så hun kunne detektere kontaktflader på proteiner og studere foldningen af proteiner. Med den teknik kunne proteinstrukturer bevares i vakuum, og dette lagde grunden for at studere strukturen af store proteiner som fx protein-protein-interaktioner ved anvendelse af massespektrometri.
En fordømmende kommentar
Carol Robinson brugte den nye teknik til at bestemme foldningen af proteiner, men hendes forskerkolleger mente, hun var skør. På det molekylære niveau foregår livet, som vi kender det, jo i vand. Inde i et massespektrometer er der et vakuum.
"Der var en virkelig fordømmende kommentar, og det var i et meget respekteret tidsskrift, Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, så det var faktisk meget svært at publicere derefter, for der blev tit refereret til den, når jeg indsendte mine forskningsartikler. Peer reviewers skrev til mig: ’Nå, har du ikke læst den her kommentar? Det er en skør idé’. Mit svar var:’ Ja, det ved jeg, men jeg tror virkelig på det’."
Underforsøget på at bevise, at massespektrometre kunne bruges til at detektere selv store intakte proteiner, måtte Carol Robinson bryde med de eksisterende standarder for, hvad der var muligt. Det krævede udvikling af et tandem-massespektrometer med forbedret ionoverførsel og et højere masse-til-ladnings-område end tidligere.
"På det tidspunkt tog spektrometrene typisk partikler op til 4.000 i masse-til-ladningsforhold. Vi ville være lidt revolutionerende og gå op til 32.000. Det er et stort spring, og jeg kan huske, folk advarede mig imod det. De sagde: ’Gå nu bare til 8.000’. Jeg sagde: ’Nej, 32.000 vil gøre, at vi kunne så meget mere’, og jeg fik en lavet og købte den’."
De nye massespektrometre beviste Carol Robinsons pointe, nemlig at proteinkomplekser bevarer deres struktur i vakuum. De gjorde det muligt for forskere at studere intakte proteinkomplekser med en molekylvægt på over 500.000 daltons og endda studere, hvordan de hang sammen.
"Vores eksperimenter viser klart, at proteinkomplekser bevarer deres struktur i massespektrometeret. I dag er de her instrumenter tilgængelige fra flere massespektrometri-producenter og anvendes overalt i medicinalindustrien til at undersøge intakte proteinbiologiske lægemidler, såsom antistoffer og membranreceptorer. Men på det tidspunkt var det en lille revolution."
Et stort gennembrud
I stedet for blot at forsøge at vise, at de kunne gøre kloge ting med et massespektrometer, valgte Carol Robinson at bevæge sig op på et helt nyt niveau.
Vi mente, at vi nu kunne svare på nogle virkelig vigtige spørgsmål, for eksempel hvordan proteinerne finder sammen i komplekser. Hvis vi ødelagde dem, ville de måske falde fra hinanden i par, i tre eller en anden kombination. Og vi kunne så fortælle ud fra de interaktioner, hvordan de oprindelig hang sammen.Den nye metode gjorde det muligt for Carol Robinson og hendes kollegaer at studere, hvordan store proteinkomplekser blev samlet, og hvordan proteiner interagerer med co-faktorer og andre proteiner. I et banebrydende projekt fandt hun strukturen af GroEL, en vigtig proteinchaperone i bakterien Escherichia coli, der også findes hos mennesker.
Chaperoner beskytter andre proteiner, mens de foldes. Så de skaber et slags beskyttende miljø. Vores teknik gjorde det muligt for os at undersøge den fantastiske struktur. Den har 14 kopier af det samme protein, der danner disse to ringe, og indeni er det foldende protein, og vi begyndte at se på, hvordan dette beskyttede miljø påvirkede foldningen.Siden da har Carol Robinsons gruppe studeret endnu vigtigere og komplekse strukturer som interaktioner mellem antistof-antigen-komplekser, og hendes metode anvendes nu rutinemæssigt til karakterisering af antistoffer i medicinalindustrien.
Dette har muliggjort hurtigere karakterisering af antistoffer og har accelereret deres anvendelse til behandling af kræft og mange andre sygdomme.Gigantiske sæbebobler
De nye metoder har etableret Carol Robinson som en sand pioner inden for anvendelse af massespektrometri til analyse af proteinkomplekser. Hun har næsten helt på egen hånd skabt et underfelt af massespektrometri proteomik - på trods af den voldsomme kritik. Det har krævet frygtløshed, innovation og kreativitet. Det sidste blev særlig tydeligt, da hun besluttede sig for at studere nogle af de mest udfordrende og vigtige strukturer i biologien: membranproteiner.
Membranproteiner er utroligt vanskelige at studere, fordi en del af proteinet eksisterer inde i en olieagtig hydrofob membran, mens delene indeni og udenfor cellen er hydrofile. Vi fik den ide til at dække dem med vaskemiddel og derefter sende dem igennem massespektrometeret i en kæmpe sæbeboble. Og på mirakuløs vis beskytter boblen dem, så de frigives i gasfasen intakte og i foldet tilstand.I en række banebrydende artikler har Carol Robinson kortlagt strukturen af proteinerne, der syntetiserer vores celles energi, ATP, samt hvordan lipider spiller en central rolle i strukturen og funktionen af de roterende ATPaser, en slags molekylære motorer involveret i omdannelse af biologisk energi i vores celler. Hendes nyere arbejde med lipidernes rolle i membranproteinkomplekser har fået hende til at studere G-proteinkoblede receptorer.
"De her membranproteiner er mål for mange lægemidler. Vi demonstrerede, at det var muligt at bibeholde lægemiddelbindinger til G-proteinkoblede receptorer, og på den måde kan vi nu identificere naturlige ligander til disse disse proteiner. Det gør det muligt at identificere nye lægemidler, der kan binde til G-proteinkoblede receptorer, og vi kan dermed målrette dem mod specifikke cellulære processer."
Fri bevægelighed
Carol Robinsons gruppes metoder bruges nu i stigende grad indenfor andre felter relateret til massespektrometri som hjælp i processen til at finde nye lægemidler. Endnu en gang har hun bevist, at hendes kritikere tog fejl, når de sagde, at hun skulle bruge andre teknikker som NMR eller elektronmikroskopi til at studere proteinkomplekserne.
"Hvis du tænker på et massespektrometer, er proteinerne ikke i opløsning, og de er heller ikke i en fast form, så de er ikke begrænset i deres bevægelighed som et krystal. Hvis man forsøger at løbe i en swimmingpool, er det virkelig hårdt arbejde - hvis du vil kunne bevæge dig frit, skal du være ude i luften, så jeg ser det, at proteinerne er i en gasfase, som en fordel i stedet for en ulempe."
Mens hendes kritikere hævdede, at proteinfoldning i vakuum var galskab, ser Carol Robinson det altså som en fordel, fordi proteinerne maksimerer deres bevægelsesfrihed. De kan udtrykke sig, og der kan læres noget af de bevægelser. Men som altid skal forskere acceptere, at selvom de selv finder egne ideer spændende, gør andre det ikke nødvendigvis.
"Hvis du gør noget som den allerførste, tror mange mennesker ikke på det. Der var heftig kritik af mine første eksperimenter, fordi folk sagde: ’Hvordan kan du måle foldning i et massespektrometer?’. Jeg har altid gerne villet gøre en forskel i forhold til menneskers sundhed, men andre sagde bare: ’Nå, virkelig. Det kommer aldrig til at ske’, men jeg tror, man bare skal bare tro på, at det vil, så lykkes det oftere."
Så det vigtigste er - ifølge Carol Robinson - at tro på sine egne ideer og følge sin lidenskab.
Jeg har haft en rigtig fin karriere inden for videnskaben, og jeg tror virkelig på, at alle kan få det, og jeg vil gerne fjerne myten om, at du skal være et geni for at være forsker. Du har brug for fantasi og kreativitet. Fremdrift og energi. Det er de vigtigste ting.Novozymes-prisen 2019 blev uddelt ved en ceremoni fredag den 15. marts 2019 til Dame Carol Robinson, professor i kemi ved University of Oxford.
